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微尺度機械測試儀MicroSquisher凝膠支架比干細(xì)胞遞送的構(gòu)建

 更新時間:2022-10-13 點擊量:1356

抽象

致密膠原 (DC) 凝膠促進(jìn)接種牙髓干細(xì)胞 (DPSC) 的成骨細(xì)胞分化,并在體外和皮下與生物活性玻璃顆粒結(jié)合時經(jīng)歷快速無細(xì)胞礦化然而,DC生物活性玻璃混合凝膠在將DPSC輸送用于骨質(zhì)部位骨再生的潛力尚未得到研究。在這項研究中,無細(xì)胞和DPSC種子DC-S53P4生物活性玻璃的功效[(53)SiO2-(23)鈉2氧-(20)曹(4)P2O5,wt%]雜交凝膠在臨界大小的小鼠顱骨缺損中進(jìn)行了研究。將骨刺激性生物活性玻璃S53P4摻入DC凝膠中,導(dǎo)致其在體外模擬體液(SBF)中加速無細(xì)胞礦化,其中在1天內(nèi)檢測到羥基碳化磷灰石。到SBF的第7天,微機械分析顯示礦化凝膠的壓縮模量增加了8倍。 生物活性玻璃對DC-S53P4中的人- DPSC的原位效應(yīng)是顯而易見的,因為它們在沒有成骨補充劑的情況下成骨分化。在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,堿性磷酸酶和I型膠原蛋白的產(chǎn)生進(jìn)一步增加。DC-S53P4構(gòu)建體的這種骨刺激作用在體內(nèi)得到證實,植入8周后,無細(xì)胞支架和DPSC接種的DC-S53P4構(gòu)建體均形成礦化和血管化的骨基質(zhì),具有成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性。然而,令人驚訝的是,體內(nèi)顯微CT分析證實,無細(xì)胞支架產(chǎn)生了更大體積的骨骼,在第3周已經(jīng)可見,并且表現(xiàn)出*的小梁結(jié)構(gòu)。這項研究的結(jié)果表明,DC-S53P4支架否定了干細(xì)胞遞送有效骨組織再生的需要,并可能加速其臨床應(yīng)用。

2. 實驗方法

DC-S53P4支架的生物活性和機械性能

如前所述,使用大久保的SBF研究了生物活性[31]。將DC和DC-S53P4支架以1:15 (mg/mL)DC/SBF比(25 mL SBF)置于SBF中,并在6 h、第1、3和7天評估礦化程度,每3天更換一次溶液[10,11]。如上所述,進(jìn)行了掃描電鏡、透射電鏡和XRD分析。在每個時間點使用微尺度機械測試儀(加拿大,cellscale,MicroSquisher)以100μm / s的壓縮速度對濕水凝膠支架進(jìn)行壓縮機械測試(n = 5)。

MicroSquisher是一個微型機械測試系統(tǒng),MicroTester細(xì)胞微壓縮可以做別人所不能做之事。更小的標(biāo)本,更好的解像力,更容易的測試設(shè)置和更好的視覺效果。應(yīng)用包括小組織樣品,水凝膠微球,細(xì)胞球體和工程化組織生長基質(zhì)。為了適應(yīng)所有用戶的廣泛應(yīng)用,CellScale推出了兩款MicroTester!

3. 結(jié)果

DC-S53P4腳手架的制造和表征

無細(xì)胞和細(xì)胞接種DC-S53P4凝膠支架表面形態(tài)的SEM顯微照片證實了在纖維膠原基質(zhì)結(jié)構(gòu)中摻入生物活性玻璃顆粒(圖1B)。將S53P4添加到DC表明膠原纖維與生物活性玻璃表面(圖1B,I)和交織的細(xì)胞S53P4和膠原纖維結(jié)構(gòu)(圖1B,II)的結(jié)合。制造的無細(xì)胞直流支架的ATR-FTIR光譜(圖1C)顯示了在1643,1550和1243 cm處通過酰胺I,II和III帶進(jìn)行的特征性膠原蛋白鍵合?1分別為[11,12]。S53P4的光譜顯示硅酸鹽振動的存在,Si-O-Si在1000和1100厘米之間?1;與SiO的非橋接氧鍵?1在 900 厘米?1 [36];和生物活性玻璃內(nèi)的大氣碳酸鹽,位于897和1400厘米處?1 [DC-S53P4支架的光譜顯示了特征性的膠原酰胺I,II和III鍵,而生物活性玻璃的摻入掩蓋了膠原側(cè)鏈在1100-800 cm中的振動?1區(qū)域,而不是顯示 Si-O-Si 和非橋接氧鍵與 SiO?1 [同樣,S53P4光譜中存在的碳酸鹽峰在雜交后再也無法觀察到[11,37]。

3.2. 無細(xì)胞DC-S53P4支架在SBF中的礦化作用

在SBF中檢查DC-S53P4雜交凝膠支架的無細(xì)胞生物活性長達(dá)7天。對DC-S53P4的SEM顯微照片的定性研究表明,SBF中礦物的形成水平隨時間的變化而增加(圖2A)。相比之下,僅DC在SBF的7天內(nèi)顯示出礦物形成的證據(jù)很少(圖。S1)。DC-S53P4 的 ATR-FTIR 光譜(圖 2B)表明 v3 PO 的吸收帶隨時間變化增加43?在 1022 厘米?1, v4 采購訂單43?在 560 和 600 厘米?1, v2 一氧化碳32?在 873 厘米?1和 v3 一氧化碳32?在 1460 厘米?1以及 v1 PO 的強化43?在 960 厘米?1,均提示HCA在膠原基質(zhì)內(nèi)的形成和生長[38]。此外,S53P4的XRD衍射圖(圖2C)顯示出無定形玻璃的特征圖案,而制造的DC-S53P4在約20°2 θ處表現(xiàn)出寬衍射圖案,這歸因于膠原纖維的隨機取向[10]。在SBF中6小時后,這種無定形的寬衍射駝峰變得更小,不那么突出。隨著浸泡時間的進(jìn)一步延長,從第1天開始觀察到與特征羥基磷灰石有關(guān)的峰(ICDD參考號009-432,圖2D),這在更長的時間內(nèi)變得更加明顯。峰的增加和變窄不僅表明DC-S53P4支架內(nèi)羥基磷灰石的增加,而且表明支架通過暴露于SBF從無定形結(jié)構(gòu)到晶體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。相比之下,SBF中的直流腳手架(圖1000)。S1)在ATR-FTIR光譜中未顯示表明磷酸鹽含量增加的峰,并且XRD模式僅顯示第7天寬峰色散的輕微指示,類似于在SBF中6 h后DC-S53P4的模式。微機械壓縮測試表明,在SBF的7天內(nèi),DC-S53P4的剛度增加了8倍(圖3)。直流與S53P4雜交和SBF時間(p<0.0001和p<0.01)的壓縮模量均有統(tǒng)計學(xué)意義增加,而僅直流支架的壓縮模量隨SBF浸泡時間的增加沒有顯著增加(p>0.05)。

圖 2

圖 2.無細(xì)胞DC-S53P4支架在SBF中的礦化進(jìn)展.(A) 在 SBF 中第 (I) 天、第 1 天 (II) 第 3 天和第 (III) 7 天時 DC-S53P4 的掃描電鏡圖像,(IV) 在第 7 天顯示 DC-S53P4 的放大倍率較高。所有比例尺 = 5 μm。(B) 指紋區(qū)域的 ATR-FTIR 光譜,描繪了 DC-S53P4 在 SBF 中 7 天內(nèi)的礦化情況。(C) SBF 中 DC-S53P4 的 XRD 圖譜和 (D) 羥基磷灰石的參考 XRD 圖譜 (ICDD 9–432)。無花果。S1 顯示了超低頻中直流的掃描電鏡、反光柵光譜和 XRD。

圖 3

圖 3.通過礦化改變腳手架機械性能。在 SBF 中 7 天內(nèi) (A) 直流和 (B) DC-S53P4 的代表性壓應(yīng)力-應(yīng)變曲線。(C)直流和DC-S53P4中平均壓縮模量隨時間的變化在SBF中。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗,誤差線± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

3.3. HDPSCS在DC-S53P4中的代謝活性和活力,體外

為了驗證DC-S53P4支架的細(xì)胞反應(yīng)和成骨潛力,在對照和成骨培養(yǎng)基(分別為CM和OGM)中在支架中培養(yǎng)接種的hDPSC長達(dá)28天。在DC-S53P4中接種的hDPSC的代謝活性最初增加后,作為培養(yǎng)時間的函數(shù)略有減少(圖4A)。在DC中接種并在CM中培養(yǎng)的hDPSC的代謝活性似乎在第7天達(dá)到峰值,隨后隨著培養(yǎng)時間的增加而降低。從第14天開始,觀察到在所有條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的代謝活性是穩(wěn)定的。第7天的活/死分析證實CM和OGM中死細(xì)胞的存在最?。?/span>圖4B)。第28天,通過使用Hoechst測定法(圖4C)測量DNA來量化支架內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量,每個支架的細(xì)胞數(shù)量都在150,000至170,000個細(xì)胞之間,并且在CM和OGM中DC和DC-S53P4之間沒有顯著差異,表明所有支架中的平衡細(xì)胞數(shù)量。

圖 4

圖 4.接種的hDPSC在DC和DC-S53P4支架中的代謝活性和活力。(A)接種在(I)DC和(II)DC-S53P4中的hDPSCs的代謝活性,如阿拉瑪藍(lán)®還原測定在對照(CM)和成骨培養(yǎng)基(OGM)中長達(dá)28天所示。(B)在第7天接種在DC-S53P4中的hDPSCs的活/死圖像,分別在(I)CM和(II)OGM中用綠色和紅色熒光指示活細(xì)胞和死細(xì)胞。比例尺 = 200 μm。(D)第28天存在的細(xì)胞數(shù)量,通過CM和OGM的赫希斯特33258 DNA測定進(jìn)行定量。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗,± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和無顯著性 (ns) > p 為 0.05。(為了解釋此圖例中對顏色的引用,讀者請參閱本文的網(wǎng)絡(luò)版本。

hDPSC種子DC-S53P4雜交支架的體礦化和成骨分化

進(jìn)行組織學(xué)分析以評估DC和DC-S53P4支架的細(xì)胞分散和礦化潛力。Masson的三色在所有條件下都顯示出均勻的細(xì)胞在兩個基質(zhì)上的分散,而茜素紅和Von Kossa染色表明,無論添加生物活性玻璃,當(dāng)應(yīng)用OGM時,鈣和磷酸鹽的沉積分別增加(圖5A)。組織學(xué)分析證實了生物活性玻璃對礦化的影響,其中在無細(xì)胞DC-S53P4支架內(nèi)觀察到輕微的礦化跡象(圖.S3)。

圖 5

圖 5.hDPSC種子直流和DC-S53P4支架的礦化和成骨分化。將支架在對照組(CM)和成骨培養(yǎng)基(OGM)中培養(yǎng),并在第28天使用組織學(xué)分析和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行評估。(A)馬森三色,茜素紅和馮·科薩的組織學(xué)染色。所有比例尺均為 100 μm。(B)ALP,I型膠原蛋白和β肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡(3個獨立實驗)。(C)ALP和I型膠原蛋白的定量。數(shù)據(jù)以歸一化為β肌動蛋白。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗,SD 和 *p ±誤差線< 0.05、**p < 0.01。(為了解釋此圖例中對顏色的引用,讀者請參閱本文的網(wǎng)絡(luò)版本。

蛋白質(zhì)分析表明,當(dāng)接種在DC-S53P4中并在OGM中培養(yǎng)時,細(xì)胞的ALP產(chǎn)量顯著增加(p <0.001)(p <0.001)(圖5B和C)。與所有其他條件相比,雜交DC-S53P4和OGM中hDPSC的培養(yǎng)也導(dǎo)致I型膠原蛋白產(chǎn)量顯著增加(p <0.05)(圖5B和C)。微機械壓縮試驗表明,在OGM培養(yǎng)時,支架壓縮模量顯著增加(p <0.001),但S53P4的存在沒有顯著影響(p = 0.37)(圖中。S2)。


4. 結(jié)論

該研究提出了一種DC-S53P4生物活性玻璃混合水凝膠作為治療臨界大小骨缺損的合適支架。體外調(diào)查證實了這些DC-S53P4支架的快速礦化和骨刺激性質(zhì)。此外,在植入無細(xì)胞支架和mDPSCs種子構(gòu)建體的臨界尺寸顱面缺陷中,在體內(nèi)觀察到具有組織膠原原纖維和血管網(wǎng)絡(luò)的礦化骨基質(zhì)。然而,新形成的骨的數(shù)量和質(zhì)量在無細(xì)胞DC-S53P4支架中出現(xiàn)較大。雖然骨愈合的機制尚未確定,但DC-S53P4支架為骨組織工程提供了一種有希望的無細(xì)胞策略。

MicroTester細(xì)胞微壓縮

MT G2

  • 壓縮、拉伸、彎曲、壓痕和剪切測試的測試模式

  • 0.1μm分辨率的高精度壓電執(zhí)行器

  • 可選雙軸成像

  • 解像力降至10nN

  • 高分辨率的CCD成像

  • 集成溫控介質(zhì)浴

  • 功能齊全的用戶界面軟件,可進(jìn)行實時反饋的簡單、循環(huán)、松弛和多模式測試

MicroTester細(xì)胞微壓縮

MT LT

  • 壓縮、拉伸、彎曲和壓痕測試的測試模式

  • 適合測各種不同的應(yīng)用,并且價格公道

  • 1μm分辨率的高精度壓步進(jìn)馬達(dá)

  • 解像力降至10nN

  • 高分辨率的CCD成像

  • 集成溫控介質(zhì)浴

  • 功能齊全的用戶界面軟件,可進(jìn)行實時反饋的簡單、循環(huán)、松弛和多模式測試

MicroSquisher 圖像



試樣和安裝

平行板壓縮
樣品:300μm水凝膠微球(30KPa)
峰力:20mN
懸臂彎
試樣:20μm厚、4mm寬箔帶(70MPa)
峰力:3mN
平行板壓縮
標(biāo)本:直徑2毫米的水凝膠圓柱體(12KPa)
峰力:20mN
球形壓痕
樣品:1.5mm直徑壓頭壓入水凝膠(2KPa)
峰力: 12mN
彎曲引起的拉伸
標(biāo)本:蜘蛛絲
峰力:2mN
穿刺附著拉伸
樣品:3.5mm寬,1.5mm厚的水凝膠(0.5KPa)
峰力:1.4mN

技術(shù)信息


MTG2MTLT
外形尺寸56 X 14 X 24cm52 X 17 X 21cm
重量9kg6.5kg
力度大小500mN500mN
可用的力傳感器0.005, 0.02, 0.08, 0.2, 1, 5, 25, 100, 500mN0.005, 0.02, 0.08, 0.2, 1, 5, 25, 100, 500mN
力的準(zhǔn)確性約換能器容量的0.2%約換能器容量的0.2%
最大夾點分離約10mm約10mm
最大速度5mm/s5mm/s
最大循環(huán)頻率0.1Hz0.1Hz
最大數(shù)據(jù)頻率5Hz5Hz
Actuator TechnologyPiezo-electric MotorStepper Motor
Actuator Resolution0.1um1um
Range of Field of View0.4-11.0mm0.8-5.5mm
Vertical Image Resolution2048px1536px
Secondary Camera OptionYesNo
Secondary Test Axis Option (Shear)YesNo